1、Treg細(xì)胞概述

　　高效免疫抑制劑的發(fā)現(xiàn)及其聯(lián)合應(yīng)用使臨床器官移植的急性排斥反應(yīng)大大降低，移植物的存活時間明顯延長；器官移植成為挽救終末期器官功能衰竭患者生命的重要有效途徑。但是免疫抑制劑具有明顯的毒副作用(如對重要臟器的損傷、降低抗腫瘤及抗感染免疫力等)及對治療慢性排斥反應(yīng)效果較差等問題，均限制了免疫抑制劑的長期應(yīng)用。因此，相關(guān)生命科學(xué)工作者嘗試通過誘導(dǎo)移植免疫耐受途徑來避免免疫抑制劑的長期應(yīng)用及克服移植免疫排斥反應(yīng)。

在上個世紀(jì)九十年代中期，由Sakaguchi等首先證實了天然CD4+ CD25+ 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)為一類具有免疫抑制作用的T細(xì)胞，約占外周血單個核細(xì)胞（PBMC）2%～5%，約占外周CD4+T細(xì)胞的5～10%。該類細(xì)胞以“主動”的方式參與免疫應(yīng)答／免疫耐受的調(diào)控，不僅參與自身免疫耐受調(diào)節(jié)，而且在腫瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。

2、Treg細(xì)胞的來源

　　研究證實，天然的CD4+CD25+Treg細(xì)胞來源于胸腺，小鼠出生后第3天切除胸腺，外周缺乏CD4+CD25+Treg細(xì)胞，產(chǎn)生抗自身抗體并出現(xiàn)自身免疫性胃炎等自身免疫性疾病。而在第0天和第7天切除胸腺，并不表現(xiàn)自身免疫性疾病。這說明出生3d內(nèi)是胸腺產(chǎn)生CD4+CD25+Treg細(xì)胞的關(guān)鍵時期，這時切除胸腺引起自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的過度增殖。但是，出生第0天胸腺產(chǎn)生的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞不足，出生第7天胸腺已經(jīng)產(chǎn)生了足夠的CD4+CD25+Treg細(xì)胞，所以這時切除胸腺， 小鼠不出現(xiàn)自身免疫性疾病。Papiernik等證實，CD4+CD25+Treg細(xì)胞產(chǎn)生于胸腺，然后遷移到外周發(fā)揮作用，CD4+CD25+胸腺細(xì)胞與外周的CD4+CD25+Treg細(xì)胞一樣，表現(xiàn)對經(jīng)由TCR的抗原刺激呈低反應(yīng)性，并且顯示抑制其他T 細(xì)胞增殖的能力。CD4+CD25+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生需要TCR與胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞的MHC II類分子間的高親和力作用，MHC II類分子缺陷的小鼠缺乏CD4+CD25+Treg細(xì)胞。CD4+CD25+Treg細(xì)胞除了在胸腺產(chǎn)生以外，還可以在未成熟的樹突狀細(xì)胞、IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低劑量抗原誘導(dǎo)下由外周CD4+CD25-細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來，該類細(xì)胞稱為誘導(dǎo)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞。

3、Treg細(xì)胞的常用的分子標(biāo)記

　?、貱D25：Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡，增加免疫耐受。研究表明，多種T細(xì)胞分子抗原參與Treg細(xì)胞的特異性功能效應(yīng)。傳統(tǒng)鑒定Treg細(xì)胞主要是通過CD4和CD25來標(biāo)記。但隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)覺只通過CD4+CD25+雙陽性來定義的Treg細(xì)胞并不完全準(zhǔn)確。

②FOXP3： FOX(forkhead box)是脊椎動物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子的總稱，是一個具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子大家族，通常和細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)控有關(guān)。FOX家族成員都有一個叉頭樣結(jié)構(gòu)域，能與DNA結(jié)合。FOXP3是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，2001年由Brunkow等首次報道。研究發(fā)現(xiàn)，它的表達(dá)及功能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，TR細(xì)胞)密切相關(guān)。如果FOXP3基因發(fā)生突變，將影響TR細(xì)胞的發(fā)育成熟，導(dǎo)致IPEX綜合征(immune dysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy，X-linked syndrome)。

　　FOXP3主要表達(dá)于胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等淋巴器官和組織。在小鼠特異性表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞，而不表達(dá)于CD8+T細(xì)胞。在人類FOXP3不僅可表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞，還可表達(dá)于CD8+CD28-T細(xì)胞。但在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于CD8+T細(xì)胞。目前，F(xiàn)oxp3(forkhead box P3，Scurfin)是目前公認(rèn)的Treg細(xì)胞的最敏感的標(biāo)志。

③CD127：最近發(fā)現(xiàn)通過表達(dá)CD4，CD25和傳導(dǎo)信號FoxP3來定義調(diào)節(jié)性T細(xì)胞時，在一類特殊的細(xì)胞群體時會出現(xiàn)問題。我們發(fā)現(xiàn)IL-7受體（CD127）在外周血CD4+T的一個亞群中會下調(diào)表達(dá)。我們證實這些細(xì)胞FoxP3陽性，且這群細(xì)胞包括那些CD25弱陽性或陰性群體。聯(lián)合使用　　CD4，CD25和CD127可得到高純度的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，比以前的通過其他標(biāo)志物來區(qū)分方法顯著提高。這些細(xì)胞在功能抑制實驗中可發(fā)揮高度抑制功能。實際上，通過CD4和CD127表達(dá)來區(qū)分的細(xì)胞數(shù)量（包括CD25+CD4+和CD25-CD4+）三倍于通過CD4+CD25hi區(qū)分的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群。最后，我們使用CD127定量檢測I型糖尿病病人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD127可作為人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)志物。

4、FOXP3流式檢測方法

　　美國eBioscience公司是最早擁有FOXP3流式檢測抗體的公司之一，公司通過不斷改進(jìn)和優(yōu)化，建立了一套完美的針對FOXP3流式檢測特殊的試劑和方案。

（1）實驗材料

實驗設(shè)備

1) 流式上樣管 

2) 混勻振蕩器

3) 離心機(jī)

4) 移液器、Tips

5) 流式細(xì)胞儀

所需試劑 

1) 細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑（CD4、CD25或CD8等）

2) FOXP3熒光標(biāo)記抗體

3) 溶血素：（eBioscience目錄號00-4333）用于裂解紅細(xì)胞

4) 淋巴細(xì)胞分離液：若樣品為人的全血，建議先用分離液分離出單個核細(xì)胞后再做后續(xù)檢測

5) 固定劑和破膜劑：（eBioscience FOXP3檢測專用試劑，目錄號為00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，將其中的Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1：3的比例混合，配制好的溶液保存時間不要超過一天）

6) 其他試劑：Flow Cytometry Staining Buffer（00-4222）或PBS，Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）等

（2）實驗操作步驟

注：對于不同的FOXP3克隆號抗體，在操作上可能存在著一些細(xì)微的差別。具體實驗時，請參考相應(yīng)的抗體說明書上的操作步驟。此操作以人Foxp3 (clone PCH101, cat. XX-4776).為例。

1、按照流式樣品要求制備單細(xì)胞懸液。

2、按照流式表面染色方法標(biāo)記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次，離心完全棄上清。斡旋分散細(xì)胞。

3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細(xì)胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品最長可以四度固定18小時）。

4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。

5、300g 室溫離心5min,棄上清。

6、2ml 1×permeabilization buffer重懸細(xì)胞。

7、300g 室溫離心5min,棄上清。

8、加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細(xì)胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞內(nèi)抗原抗體），室溫避光孵育20min。

9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室溫離心5min,棄上清。

10、加2ml 流式染色液，300g 室溫離心5min,棄上清。

11、適量流式染色液重懸，即可上機(jī)檢測。同行對照依照上述步驟進(jìn)行。軟件分析結(jié)果。

　　注：在染胞內(nèi)或胞核內(nèi)的因子時，要對細(xì)胞進(jìn)行固定和破膜，因此，與活細(xì)胞相比，在形態(tài)上會有一定變化，因此必須對所有細(xì)胞樣本進(jìn)行固定和破膜；若對Blank和染色細(xì)胞沒做固定和破膜，在FSC/SSC圖中對固定和破膜的樣品細(xì)胞圈門時需要做一定調(diào)整。